Вирусологический ликбез. Основы лабораторной диагностики вирусных инфекций

Некоторые вирусные инфекции могут быть распознаны неспециалистом (например, высыпания герпеса на губах). Во время эпидемии, скажем, гриппа, правильный диагноз может поставить почти каждый. Опытный инфекционист по клиническим признакам может диагностировать многие инфекционные заболевания. Но каков бы ни был «глаз-алмаз» клинициста, без данных лабораторных исследований, особенно, в неэпидемической ситуации, не обойтись. Ну а бессимптомную или «вялотекущую» вирусную инфекцию без «лаборатории» вообще невозможно диагностировать.

Тестов для диагностики вирусных заболеваний, которые сейчас «в ходу», великое множество. Однако их информативность зависит от контекста и у различных тестов сильно отличается. Для того, чтобы оценить адекватность использования того иди иного теста в конкретной клинической ситуации нужно много знать и, в принципе, это дело лечащего врача. Но немного ориентироваться в этом, особенно в условиях «рынка медицинских услуг» не лишне никому.

Я не буду вдаваться в технологические детали тестов. Постараюсь лишь дать некоторые общие ориентиры.

Начну с разделения на диагностику (1) вирусной инфекции и (2) вирусного заболевания. В первом случае необходимо установить есть ли вирус в организме исследуемого или нет. Во втором, установить, что наблюдаемый клинически «набор» симптомов и признаков, является следствием инфицированности тем или иным вирусом и у пациента конкретное заболевание. Медицина, не математика. Определения понятий и смысла терминов здесь нестрогие. Относится это и к понятию «инфекция». Так, вопреки смыслу, сформулированному выше, этим словом часто называют инфекционные заболевания. Даже врачи, специалисты в этой области, называются инфекционистами. Но, несмотря на неоднозначность термина «инфекция», в контексте вирусной диагностики простая схема «инфекция – заболевание» многое ставит на свои места.

Диагностика вирусной инфекции (в том, смысле, как она определена выше) задача попроще и в этой области возможности быстро расширяются. Диагностика вирусного заболевания намного сложнее и требует интеграции различных лабораторных и клинических данных. 

Однако демаркация этих двух «сфер» вирусологической диагностики неполная. Есть случаи, когда обнаружение вируса эквивалентно диагнозу заболевания. Например, тестирование на вирус образца цереброспинальной жидкости обнаруживает там вирус простого герпеса (HSV-1). У здоровых людей эта жидкость стерильна. В таком случае результат анализа «на инфекцию» даёт ответ какое заболевание у пациента – герпесный энцефалит или менингоэнцефалит. Но тот же тест, скажем, слюны, может быть положительным и у здорового человека. Не буду углубляться в примеры такого рода. Несмотря на подобные «исключения», понимание того, обнаруживает ли тест присутствие вируса (минимальная интерпретация – есть соответствующая инфекция) или что-то помимо этого, или другое, очень полезно для ориентировки в «дебрях» диагностических тестов.

Следующее полезное разделения вирусологических диагностических тестов – «прямые» и «непрямые».

Прямые тесты обнаруживают непосредственно вирус или его компоненты, которые однозначно свидетельствует о присутствии вируса в организме.

Непрямые тесты обнаруживают реакции организма на присутствие вируса. В идеале, речь идёт о строго специфических реакциях.

Основные типы прямых тестов следующие:

1) Выделение вируса в клеточной культуре

2) Поиск вирионов под электронным микроскопом

3) Определение вирусных антигенов

4) Определение вирусных ДНК или РНК

Первые два, особенно электронная микроскопия, сейчас в практической диагностике почти не используются. Определение вирусных антигенов актуально. У многих в этой области есть и личный опыт («домашний» тест на КОВИД). Но всё шире в вирусологической диагностике используются тесты, в основе которых лежит детекция вирусной ДНК или РНК. Пожалуй, наиболее известен среди них ПЦР. Поскольку эти тесты «пришли» из молекулярной биологии их часто называют «молекулярными».

Что касается непрямых тестов, то это:

1) Определение антител против вирусных антигенов

2) Определение вирус-специфических Т-клеток

3) Определение изменений в клеточных популяциях, которые характерны для той или иной вирусной инфекции

В практической диагностике широко используются только тесты на антитела. Вирус-специфические Т-клеточные тесты слишком сложны, дороги, и есть трудности в интерпретации их результатов в ключе, необходимом клиницистам. Оценка изменений в популяциях клеток крови сейчас используется довольно широко. А при медицинском сопровождении ВИЧ-инфицированных/больных СПИДом, такого типа тест (количество CD4+ лимфоцитов) просто необходим.

Интерпретация антительных тестов не столь однозначна, как в случае прямых тестов. Антитела могут быть как индикатором присутствия вируса в организме, так и «следом» который вирус оставил. У антительных тестах бОльшая, чем у прямых тестов «склонность» давать ложные результаты. Отчасти, это связано с использование недостаточно очищенных антигенов. Но есть и фундаментальные ограничения. Например, для того, чтобы выработались антитела необходимо время (от недель до месяцев). А при некоторых иммунодефицитах антитела могут не выработаться вовсе. Есть и другие проблемы, не буду в это углубляться.

И ещё один ориентир, очень важный, но почему-то часто теряемый в «мишуре» деталей конкретных диагностических технологий. Я имею в виду всё, что связано с такими характеристиками как специфичность и чувствительность. Эти термины  звучат часто в медицинской речи. Нередки, по сути рекламные заявления о том, что тот или иной тест имеет чувствительность и специфичность 100%. Попутно звучит, что тест способен обнаружить всего несколько вирусных частиц (или молекул геномов). Но как один и то же параметр может измеряться в процентах и количеством частиц/молекул?

Дело в том, что есть две очень разные «среды обитания» для этих терминов и их смысл сильно меняется в зависимости от того, в какой из этих сред ими оперируют. Первая из них это «сред обитания» экспериментаторов, а вторая клиницистов. Они как бы говорят на разных «языках». Чувствительность на языке экспериментатора — это минимальное количество искомого вещества, вплоть до единичных молекул, которое может обнаружить тот или иной аналитический метод. А под специфичностью экспериментатор понимает способность того или иного метода обнаруживать только единственное искомое вещество и не реагировать ни на что более.

У клинициста другие приоритеты. Клиницисту важно, чтобы тест надёжно распознавал что-то, что, в конечном итоге, полезно для диагностики болезни. Иными словами, если клиницист ищет болезнь, вирус, бактерию, поражение органа и т.д., то соответствующая тест должна давать положительный результат, когда искомое есть, и отрицательный результат, когда этого нет. На языке клиницистов 100% чувствительность теста на болезнь Х означает, что диагностический тест правильно идентифицирует всех, у кого есть болезнь Х.  А 100% специфичность это способность этого же теста правильно идентифицировать всех, у кого болезни X нет.

Чувствительность и специфичность в понимании экспериментаторов называются аналитическими, а эти же термины в понимании клиницистов должны дополняться уточнением - диагностические. К сожалению, в таком корректном виде термины чувствительность и специфичность используются редко. Но пользоваться ли уточнёнными терминами или нет, нужно понимать, что аналитическая и диагностическая чувствительность / специфичность это «две большие разницы». 

Одно из важнейших отличий между аналитической и диагностической чувствительностью/специфичностью состоит в том, что в аналитическом понимании это атрибуты метода, а в диагностическом нет. Иными словами, при правильном исполнении теста аналитические чувствительность и специфичность воспроизводимы (в пределах экспериментальной ошибки) и являются характеристиками, присущими именно методу. А диагностическая чувствительность и специфичность, хотя и зависят от метода, но, помимо этого, они зависят и от стадии заболевания у исследуемого и от того, какой образец у него взят и от многого другого.

Ещё один очень важный момент. Люди непосвященные, как правило, по умолчанию, полагают, что медицинский тест, особенно если он выполнен на «высокотехнологичном» оборудовании, даёт только два варианта ответа – либо положительный (болезнь, не норма), либо отрицательный (здоровье, норма). Но это не так. Все методы диагностики с большей или меньшей частотой дают «неправильные результаты». Таким образом, у любого диагностического теста есть 4 возможных результата:

1. Истинно-положительный
2. Истинно-отрицательный
3. Ложно-положительный
4. Ложно-отрицательный

Но как различить какой результат истинный, а какой ложный? Иногда, особенно в клинической практике, это очень сложно. Некоторые ориентиры дают оценки диагностической чувствительности и специфичности, сделанные производитем теста. Для этого необходимы эталонные положительные и отрицательные контрольные образцы. Предположим, что из 100 положительных эталонных образцов оцениваемый тест дал положительный результат в 99 случаях, а один положительный образец он не обнаружил (т.е. в этом случае результат был отрицательным). Это означает, что диагностическая чувствительность теста равна 99%, а неправильный результат «ложно-отрицательный». Сходным образом оцениваемый тест правильно идентифицировал 98 из 100 отрицательных образцов, а два определил как положительные. Это означает, что диагностическая специфичность теста равна 98%, а неправильные результаты «ложно-положительные».

Резонен вопрос – на основании чего эталонные образцы «объявлены» таковыми т.е. «истинно» положительными или отрицательными. Для ответа на этот вопрос необходим «золотой стандарт» - эталонный тест, в котором определено какие эталонные образцы положительные, а какие отрицательные. Без чёткого определения «золотого стандарта» понятия диагностической чувствительности и специфичности лишены смысла. Золотой стандарт не есть нечто абсолютное. Сегодня он один, завтра может появиться другой. Но всегда, когда говорят о диагностической чувствительности и специфичности какого-либо теста, должно быть четко оговорено, по отношению к какому «золотому стандарту» они определены.

Чувствительностью и специфичностью количественные оценки надёжности диагностических тестов не исчерапываются. Но пока, думаю, этого достаточно.  

Длинновато сегодня получилось, но я решил, что вместо ссылки на старый пост о чувствительностях и специфичностях, лучше включить его основные положения в пост сегодняшний.

Вот так, на мой взгляд, выглядят «несущие конструкции», которые должны быть возведены до заполнения этого пространства «высокотехнологическими» деталями. 

Проф_АФВ